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人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）是一種嗜上皮組織的無(wú)包膜雙鏈環(huán)狀DNA病毒，目前已發(fā)現(xiàn)約200種不同HPV型別。根據(jù)其致病力的大小可以分為高危型HPV和低危型HPV。高危型HPV包括HPV16、18、26、31、33、35、39等，可以引起外生殖器癌、宮頸癌、高度外陰瘤變和其他部位的惡性病變等。低危型HPV主要包括HPV6、11、40、42、43、44等，主要引起肛門(mén)-外生殖器疣和皮膚疣等良性病變。HPV病毒的基因組按功能可分為早期編碼區(qū)（E區(qū)）、晚期編碼區(qū)（L區(qū)）以及非編碼區(qū)。早期編碼區(qū)主要負(fù)責(zé)病毒DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控，其中E6、E7在高危型HPV導(dǎo)致癌癥中發(fā)揮重要作用。晚期編碼區(qū)參與病毒衣殼蛋白的合成，包括主要衣殼蛋白L1和次要衣殼蛋白L2。

椿乳凝膠主要由椿皮、苦參、牡丹皮、乳香、冰片等中藥組方而成，為名老中醫(yī)多年的經(jīng)驗(yàn)方，并且有10多年的醫(yī)院制劑使用史。方中君藥椿皮清熱祛濕、止帶?？鄥ⅰ⒌てで鍩嵩餄?、止癢為臣藥，以增強(qiáng)君藥。乳香活血化瘀、生肌，冰片散熱消腫、止癢為佐藥，以助主藥?kù)铕錾?。全方具有清熱燥濕、祛瘀生肌的功效，主要用于慢性宮頸炎之宮頸糜爛及中醫(yī)辨證屬于濕熱瘀阻者。

HPV病毒具有高度的宿主和組織特異性，只能特異性感染人的黏膜、皮膚上皮細(xì)胞，并且依賴(lài)上皮細(xì)胞的分化進(jìn)行復(fù)制，因此目前尚無(wú)法對(duì)HPV病毒進(jìn)行有效的體外培養(yǎng)，同時(shí)也缺乏合適的天然動(dòng)物模型，通過(guò)構(gòu)建HPV假病毒成為目前研究HPV簡(jiǎn)單有效的方法。本研究通過(guò)多質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染方法構(gòu)建了HPV6、HPV11假病毒，對(duì)該HPV假病毒的感染能力進(jìn)行了分析，并利用該假病毒成功建立了HPV感染小鼠陰道模型。通過(guò)研究椿乳凝膠對(duì)HPV6、HPV11假病毒感染的293FT細(xì)胞的形態(tài)和增殖、細(xì)胞周期的影響，以及椿乳凝膠對(duì)HPV6、HPV11假病毒感染小鼠的影響，綜合評(píng)價(jià)椿乳凝膠對(duì)低危型HPV6、HPV11的藥效作用，為臨床用藥提供參考依據(jù).

1、材料

1.1  動(dòng)物

SPF級(jí)雌性BALB/c小鼠100只，體質(zhì)量15.6～18.8 g，購(gòu)自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（京）2019-0010。小鼠飼養(yǎng)于湖南普瑞瑪藥物研究中心有限公司病原微生物實(shí)驗(yàn)室，實(shí)驗(yàn)室備案編號(hào)長(zhǎng)衛(wèi)計(jì)實(shí)備字（2021）第B010號(hào)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK（湘）2020-0015。動(dòng)物研究遵循湖南普瑞瑪藥物研究中心有限公司動(dòng)物倫理委員會(huì)的指導(dǎo)方針，倫理批準(zhǔn)號(hào)IACUC-2021（3）037。

1.2  細(xì)胞

人胚腎293FT細(xì)胞購(gòu)自上海中喬新舟生物科技有限公司。

1.3 儀器 

BCR-MI02-72-C11-PPSU型小鼠獨(dú)立通氣籠盒系統(tǒng)、BSC1300-Ⅱ-B2型生物安全柜（山東新華醫(yī)療器械股份有限公司）；ST8R型臺(tái)式高速大容量冷凍離心機(jī)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀、CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；流式細(xì)胞儀（BD公司）；Spectra Max i3x型酶標(biāo)儀（Molecular Devices公司）；5200 Multi型化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)、雙垂直電泳儀、轉(zhuǎn)印電泳儀（Tanon公司）；倒置熒光顯微鏡（德國(guó)Leica公司）；AniView100型多模式動(dòng)物活體成像系統(tǒng)（廣州博鷺騰生物科技有限公司）。

1.4  藥品與試劑

椿乳凝膠（批號(hào)20191205）由株洲千金藥業(yè)股份有限公司提供；報(bào)告質(zhì)粒pcDNA3.1-EGFP-HPV6-E6/E7、pcDNA3.1-EGFP-HPV11-E6/E7送至通用生物（安徽）系統(tǒng)有限公司合成；表達(dá)質(zhì)粒pCMV-HPV6-L1-flag-L2-6*His、pCMV-HPV11-L1-flag-L2-6*His送至武漢中邁盈科生物科技有限公司合成；DMEM培養(yǎng)基（批號(hào)AF29584966）購(gòu)自HyClone公司；胎牛血清（fetal ovine serum，F(xiàn)BS，批號(hào)M009-6）購(gòu)自Sciencell公司；Lipo-fectamine 2000（批號(hào)2117484）、細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒（批號(hào)2117484）購(gòu)自Invitrogen公司；Opti-MEM?（批號(hào)31985070）、High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit（批號(hào)4368814）、PowerUP SYBR Green Master Mix（批號(hào)A25742）、Prestained Protein Ladder（批號(hào)26617）購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；CellTiter-Glo發(fā)光法細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒（批號(hào)C0065M）、RIPA裂解液（強(qiáng)）（批號(hào)P0013B）、SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒（批號(hào)P0012AC）、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（批號(hào)P0018A）購(gòu)自碧云天生物試劑公司；DH5α感受態(tài)細(xì)胞（批號(hào)CB101）、無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒（批號(hào)DP117）購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；RNA提取試劑盒（批號(hào)RC101）購(gòu)自Vazyme；β-actin引物（批號(hào)H309KA9183）購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；PVDF膜（批號(hào)IPVH00010）購(gòu)自Merck Millipore；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（批號(hào)AS014）、HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體（批號(hào)AS003）、β-actin抗體（批號(hào)AC026）購(gòu)自Abclonal公司；HPV6 E7抗體（批號(hào)LS-C144095）購(gòu)自LSBio公司；HPV11 E7抗體（批號(hào)ab100967）購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；鬼臼毒素（批號(hào)M0521B）購(gòu)自蘇州美侖生物科技有限公司；苯甲酸雌二醇注射液（批號(hào)20190312）購(gòu)自四川金科藥業(yè)有限責(zé)任公司椿乳凝膠（批號(hào)20191205）由株洲千金藥業(yè)股份有限公司提供；報(bào)告質(zhì)粒pcDNA3.1-EGFP-HPV6-E6/E7、pcDNA3.1-EGFP-HPV11-E6/E7送至通用生物（安徽）系統(tǒng)有限公司合成；表達(dá)質(zhì)粒pCMV-HPV6-L1-flag-L2-6*His、pCMV-HPV11-L1-flag-L2-6*His送至武漢中邁盈科生物科技有限公司合成；DMEM培養(yǎng)基（批號(hào)AF29584966）購(gòu)自HyClone公司；胎牛血清（fetalbovine serum，F(xiàn)BS，批號(hào)M009-6）購(gòu)自Sciencell公司；Lipo-fectamine 2000（批號(hào)2117484）、細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒（批號(hào)2117484）購(gòu)自Invitrogen公司；Opti-MEM?（批號(hào)31985070）、High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit（批號(hào)4368814）、PowerUP SYBR Green Master Mix（批號(hào)A25742）、Prestained Protein Ladder（批號(hào)26617）購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；CellTiter-Glo發(fā)光法細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒（批號(hào)C0065M）、RIPA裂解液（強(qiáng)）（批號(hào)P0013B）、SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒（批號(hào)P0012AC）、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（批號(hào)P0018A）購(gòu)自碧云天生物試劑公司；DH5α感受態(tài)細(xì)胞（批號(hào)CB101）、無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒（批號(hào)DP117）購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；RNA提取試劑盒（批號(hào)RC101）購(gòu)自Vazyme；β-actin引物（批號(hào)H309KA9183）購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；PVDF膜（批號(hào)IPVH00010）購(gòu)自Merck Millipore；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（批號(hào)AS014）、HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體（批號(hào)AS003）、β-actin抗體（批號(hào)AC026）購(gòu)自Abclonal公司；HPV6 E7抗體（批號(hào)LS-C144095）購(gòu)自LSBio公司；HPV11 E7抗體（批號(hào)ab100967）購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；鬼臼毒素（批號(hào)M0521B）購(gòu)自蘇州美侖生物科技有限公司；苯甲酸雌二醇注射液（批號(hào)20190312）購(gòu)自四川金科藥業(yè)有限責(zé)任公司。

2、方法

2.1 HPV6、HPV11假病毒構(gòu)建

2.1.1  質(zhì)粒常規(guī)轉(zhuǎn)化與大量提取  

從?80 ℃冰箱取出4管DH5α感受態(tài)細(xì)胞置冰上，分別向4管感受態(tài)細(xì)胞懸液中加入0.5～1 μL預(yù)冷的目的質(zhì)粒，加入預(yù)熱的200 μL LB液體培養(yǎng)基，混勻后于37 ℃、200 r/min搖床振蕩1 h。吸取細(xì)胞加到含相應(yīng)抗生素的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)12～15 h。挑取平板上單個(gè)菌落接種（或者直接取對(duì)應(yīng)合成質(zhì)粒的菌液100～200 μL）至2 mL含相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，用無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒提取質(zhì)粒，Nanodrop測(cè)定質(zhì)粒純度與濃度，于?20 ℃保存?zhèn)溆谩?/span>

2.1.2  結(jié)構(gòu)基因表達(dá)質(zhì)粒與報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至293FT細(xì)胞  

轉(zhuǎn)染前1天，按1×106/mL的密度將293FT細(xì)胞鋪于6孔板中，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，待細(xì)胞長(zhǎng)至密度約為70%時(shí)即可進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，利用Lipo-fectamine 2000將結(jié)構(gòu)基因表達(dá)質(zhì)粒分別與報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至293FT細(xì)胞，同時(shí)設(shè)置分別轉(zhuǎn)染單個(gè)報(bào)告質(zhì)粒為陰性對(duì)照組。①轉(zhuǎn)染0.5 h之前把培養(yǎng)孔板中的DMEM完全培養(yǎng)基換成無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行饑餓處理，且用量減半；②首先將轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000、對(duì)照組質(zhì)粒和實(shí)驗(yàn)組質(zhì)粒（pcDNA3.1-EGFP-HPV6/11-E6/E7：pCMV-HPV6-L1-flag-L2-6*His＝1∶1，2種質(zhì)粒均取1.25 μg）分別用Opti-MEM培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋?zhuān)胖? min；③將Lipofectamine 2000分別與對(duì)照組質(zhì)粒和實(shí)驗(yàn)組質(zhì)?；旌希鰷u混勻，放置20 min；④將轉(zhuǎn)染混合液加入已換成無(wú)血清培養(yǎng)基的培養(yǎng)板中，48～72 h后收獲假病毒，進(jìn)行病毒滴度測(cè)定。

2.1.3  病毒滴度測(cè)定  

將293FT細(xì)胞按1.5×104/mL的密度鋪于96孔板中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。將HPV6/11假病毒用DMEM培養(yǎng)基分別進(jìn)行1×10?1、1×10?2、1×10?3、1×10?4、1×10?5倍稀釋?zhuān)「魈荻炔《鞠♂屢?00 μL加入293FT細(xì)胞中，每個(gè)稀釋梯度8個(gè)復(fù)孔，將96孔板放入37 ℃培養(yǎng)箱孵育72 h后，置于倒置熒光顯微鏡下觀察，出現(xiàn)1個(gè)以上病變細(xì)胞定為陽(yáng)性孔。用Reed-Muench方法計(jì)算細(xì)胞培養(yǎng)半數(shù)感染量（half of tissue culture infective dose，TCID50），即病毒感染一半細(xì)胞時(shí)的病毒稀釋度。

2.2  椿乳凝膠體外試驗(yàn)

2.2.1  椿乳凝膠對(duì)293FT細(xì)胞形態(tài)及增殖的影響  

將293FT細(xì)胞按1.5×104/mL的密度鋪于96孔板中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。待細(xì)胞長(zhǎng)成單層細(xì)胞后，用PBS溶液洗滌細(xì)胞2～3次，將椿乳凝膠（40 mg/mL）用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基分別稀釋6個(gè)質(zhì)量濃度（1000、500、250、125、62.5、31.25 μg/mL）；鬼臼毒素設(shè)置6個(gè)濃度（100、50、25、12.5、6.25、3.125 μmoL/L），取每組藥物100 μL加入96孔板中，同時(shí)設(shè)置溶媒對(duì)照組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于24、48、72 h后于倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)，采用CellTiter-Glo發(fā)光法測(cè)定72 h后的細(xì)胞活性，并計(jì)算椿乳凝膠和鬼臼毒素的半數(shù)抑制濃度（half inhibitory concentration，IC50）及TC0（IC20），共重復(fù)3次。

2.2.2  椿乳凝膠對(duì)HPV6、HPV11假病毒感染力的影響  

將293FT細(xì)胞按1.5×104/mL的密度鋪于96孔板中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。用培養(yǎng)基將椿乳凝膠（125 μg/mL）和鬼臼毒素（3.12 μmoL/L）進(jìn)行多濃度稀釋。待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)約80%左右時(shí)棄培養(yǎng)液加入100倍TCID50病毒液，100 μL/孔，再加入100 μL/孔的椿乳凝膠（125 μg/mL）和鬼臼毒素（3.12 μmoL/L），同時(shí)設(shè)置溶媒對(duì)照組（單純加入DMEM培養(yǎng)基），每組8個(gè)復(fù)孔，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24～72 h后。共重復(fù)3次，于倒置熒光顯微鏡下觀察并記錄實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的細(xì)胞病變情況。

2.2.3  椿乳凝膠對(duì)293FT細(xì)胞周期的影響 

將293FT細(xì)胞按1.5×106/孔的密度鋪于6孔板中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%左右時(shí)，用PBS溶液洗滌細(xì)胞2～3次，加入100倍TCID50病毒液，100 μL/孔。在100 μL/孔培養(yǎng)基中分別加入低、中、高質(zhì)量濃度（32.3、64.6、129.2 μg/mL）的椿乳凝膠和鬼臼毒素（3.12 μmoL/L），同時(shí)設(shè)置病毒對(duì)照組和溶媒對(duì)照組。將細(xì)胞培養(yǎng)板置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育48 h后，1000 r/min離心3 min收集細(xì)胞；加入10 μL碘化丙啶（PI）至終濃度20 μg/mL（用190 μL 1×Binding Buffer稀釋?zhuān)? ℃避光染色30 min，離心；加入200 μL 1×Binding Buffer清洗，離心；加入200 μL PBS溶液重懸細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期數(shù)據(jù)的收集和分析（單次流式細(xì)胞儀檢測(cè)，1份樣品細(xì)胞數(shù)量約106）。

2.2.4  椿乳凝膠對(duì)293FT細(xì)胞凋亡的影響  

將293FT細(xì)胞按1.5×106/孔的密度鋪于6孔板中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%左右時(shí)，用PBS溶液洗滌細(xì)胞2～3次，加入制備得到的100倍TCID50的HPV6和HPV11假病毒液，100 μL/孔。繼續(xù)培養(yǎng)2 h后更換為低、中、高質(zhì)量濃度（32.3、64.6、129.2 μg/mL）的椿乳凝膠和鬼臼毒素（3.12 μmoL/L），100 μL/孔，同時(shí)設(shè)置病毒對(duì)照組和溶媒對(duì)照組。將細(xì)胞培養(yǎng)板置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育48 h后，1000 r/min離心3 min收集細(xì)胞，用PBS輕輕吹打洗滌細(xì)胞2次，用200 μL 1×Binding Buffer重懸細(xì)胞，再用195μL細(xì)胞懸液中加入Annexin V-FITC，室溫混合孵育10min；加入200 μL 1×Binding Buffer洗滌細(xì)胞，再用190 μL 1×Binding Buffer重懸細(xì)胞，加入PI室溫孵育10 min后，加入200 μL 1×Binding Buffer清洗細(xì)胞；加入200 μL PBS溶液重懸細(xì)胞，進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)，共重復(fù)3次。

2.3  椿乳凝膠對(duì)HPV6、HPV11假病毒感染BALB/c小鼠模型的影響

2.3.1  造模、分組與給藥  

取雌性BALB/c小鼠100只，每只動(dòng)物sc 0.1 μg苯甲酸雌二醇，1次/d，連續(xù)3 d，第3天下午取25 μL HPV假病毒與15 μL 4%羧甲基纖維素（CMC）的混合物灌入小鼠陰道內(nèi)進(jìn)行感染，另取16只對(duì)照組小鼠灌入40 μL的4% CMC進(jìn)行處理；假病毒感染48 h之后，乙醚輕微麻醉小鼠，利用多模式動(dòng)物活體成像系統(tǒng)檢測(cè)小鼠陰道內(nèi)熒光的表達(dá)情況。選取造模成功的BALB/c小鼠80只，按體質(zhì)量隨機(jī)分為模型組、鬼臼毒素組（1 mg/只）和椿乳凝膠低、中、高劑量（0.01、0.02、0.04 g/只）組，每組16只。采用稱(chēng)量好的陰道裝藥器，經(jīng)陰道推注相應(yīng)的藥物，每天給藥1次，連續(xù)20 d。

2.3.2  pH值檢測(cè)  

分別于給藥后10、20 d采用無(wú)菌棉簽進(jìn)行陰道分泌物的取樣。取材部位為小鼠的宮頸口或?qū)m頸后穹窿，分泌物使用一次性無(wú)菌陰道拭子采集，圓周滾動(dòng)3次，采用0.1級(jí)精密pH試紙檢測(cè)陰道分泌物的pH值

2.3.3  組織病理檢查  

末次給藥后各組選取8只動(dòng)物頸椎脫臼處死，解剖取陰道、子宮組織進(jìn)行蘇木素-伊紅（HE）染色觀察小鼠陰道、子宮及子宮頸組織形態(tài)學(xué)變化。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：上皮細(xì)胞正常，且未見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，計(jì)為0分；上皮細(xì)胞壞死，計(jì)為1分；上皮細(xì)胞壞死及增生，計(jì)為2分；上皮細(xì)胞壞死及增生，且炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，計(jì)為3分。

2.3.4  宮頸組織病毒滴度檢測(cè) 

取一定量的組織勻漿，離心取上清液，在96孔板中接種293T細(xì)胞，第2天用完全培養(yǎng)基按（1～1×10?9）10個(gè)梯度稀釋病毒液，每孔加入100 μL稀釋后的病毒液，每個(gè)梯度設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔；48 h后觀察細(xì)胞中綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的表達(dá)，若1×10?8梯度孔中分別有2、3、4個(gè)細(xì)胞GFP，則取平均值，此病毒滴度為3×108 TU/mL。采用血凝抑制試驗(yàn)檢測(cè)宮頸懸液的血凝抑制滴度（以完全抑制紅細(xì)胞凝集的最大稀釋倍數(shù)為血凝抑制滴度），以log2（最大稀釋倍數(shù)），反映宮頸中病毒效價(jià)。

2.3.5  HPV6 E6/E7、HPV11 E6/E7 mRNA檢測(cè)  

取各組宮頸組織，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行PCR反應(yīng)，根據(jù)Genbank里的基因數(shù)據(jù)，使用Primer Premier6和Oligo7軟件設(shè)計(jì)引物序列。內(nèi)參為β-actin。設(shè)定對(duì)照基因表達(dá)量為100，以目的基因占對(duì)照基因相對(duì)百分含量代表目的基因表達(dá)量。引物序列：HPV6 E6上游引物5’-TGTTTCAGGACC- CACAGGAG-3’，下游引物5’-TCACGTCGCAGT- AACTGTTG-3’；HPV6 E7上游引物5’-CAGCTC- AGA GGAGGAGGATG-3’，下游引物5’-AACCGA- AGCGTAGAGTCACA；HPV11 E6上游引物5’-CACTATAGAGGCCAGTGCCA-3’，下游引物5’-CTTGTGTTTCTCTGC GTC GT；HPV11 E7上游引物5’-CGAACCACAACGTCACACAA-3’，下游引物5’-AGAAACAGCTGCTGGAATGC-3’。

2.3.6  HPV6、HPV11 E7蛋白表達(dá) 

留取樣本用BCA法測(cè)定蛋白濃度，制備分離膠、濃縮膠，上樣，電泳。將電泳后凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜，ECL顯色曝光。目的蛋白相對(duì)表達(dá)量為目的蛋白條帶灰度值與β-actin條帶灰度值比值。

2.3.7  統(tǒng)計(jì)學(xué)方法  

用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果用表示，多組間比較采用方差分析。

3、結(jié)果

3.1  椿乳凝膠體外試驗(yàn)

3.1.1  HPV6、11假病毒滴度測(cè)定 

HPV6/11假病毒滴度測(cè)定結(jié)果如表1所示。根據(jù)公式logTCID50＝log（高于50%的死亡百分?jǐn)?shù)的稀釋度）+（距離比例×log稀釋倍數(shù)）可知，TCID50終點(diǎn)稀釋比例為1∶630.95，即測(cè)定HPV6/11假病毒中，每0.1 mL接種量含有630個(gè)TCID50單位。因此，把HPV6/11假病毒原液用DMEM培養(yǎng)基按照1∶6.3倍稀釋即可得100 TCID50。

表1  HPV6/11假病毒的滴度測(cè)定出現(xiàn)CPE孔的統(tǒng)計(jì) (, n = 8)

3.1.2  椿乳凝膠對(duì)293FT細(xì)胞形態(tài)及增殖的影響  

如表2所示，椿乳凝膠對(duì)293FT細(xì)胞的IC50為333.80μg/mL，TC0為129.20 μg/mL，鬼臼毒素在100～3.12 μmol/L濃度對(duì)293FT細(xì)胞的毒性差異不大，試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)未檢測(cè)到鬼臼毒素對(duì)293FT細(xì)胞的IC50和TC0。加入椿乳凝膠溶液（1000～31.25 μg/mL）處理24～72 h后對(duì)293FT細(xì)胞形態(tài)的影響見(jiàn)圖1，對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)呈圓形，棱角分明。與對(duì)照組比較，椿乳凝膠干預(yù)組中細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)明顯變化，以細(xì)胞脫落，皺縮為主，提示藥物干預(yù)后細(xì)胞增殖受到一定的抑制作用。

表2  椿乳凝膠和鬼臼毒素對(duì)293FT細(xì)胞的毒性結(jié)果 (, n = 3)

圖1  椿乳凝膠對(duì)293FT細(xì)胞形態(tài)的影響

3.1.3  椿乳凝膠對(duì)HPV6、HPV11假病毒感染力的影響  

如圖2所示，與溶媒對(duì)照組比較，病毒感染48 h后，病毒對(duì)照組細(xì)胞出現(xiàn)明顯的增殖速度減慢，細(xì)胞碎片增多、細(xì)胞間的間隙增大等病變現(xiàn)象。與病毒對(duì)照組比較，椿乳凝膠干預(yù)后細(xì)胞病變程度明顯減少，表明其有一定抑菌病毒增殖的能力；至培養(yǎng)72 h后，椿乳凝膠抑制病毒的效果呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)，病毒對(duì)照組與椿乳凝膠干預(yù)組出現(xiàn)細(xì)胞病變的差異性不大，鬼臼毒素在72 h表現(xiàn)出一定抑制病毒增殖的能力。提示隨著時(shí)間的延長(zhǎng)椿乳凝膠抗病毒的能力慢慢減弱，需連續(xù)給藥增強(qiáng)藥效。綜上所述，椿乳凝膠對(duì)HPV6/HPV11病毒的感染有一定的抑制作用。

圖2  椿乳凝膠對(duì)假病毒感染293FT細(xì)胞的影響

3.1.4  椿乳凝膠對(duì)293FT細(xì)胞周期的影響  

PI單染流式細(xì)胞儀分析293FT細(xì)胞周期中各期細(xì)胞的變化，結(jié)果見(jiàn)圖3。HPV6/HPV11感染48 h后，細(xì)胞中G0/G1期細(xì)胞比例顯著低于溶媒對(duì)照組，S期細(xì)胞比例高于溶媒對(duì)照組，G2/M細(xì)胞比例與溶媒對(duì)照組相比無(wú)顯著差異。椿乳凝膠低、中、高劑量組G0/G1期細(xì)胞比例顯著高于HPV6/HPV11組，S期細(xì)胞比例低于HPV6/HPV11組，G2/M細(xì)胞比例低于HPV6/HPV11組。椿乳凝膠組G0/G1期細(xì)胞比例低于溶媒對(duì)照組，與鬼臼毒素組相比G0/G1期細(xì)胞比例無(wú)顯著差異。

圖3  PI單染流式細(xì)胞儀分析293FT細(xì)胞周期

3.1.5  椿乳凝膠對(duì)293FT細(xì)胞凋亡的影響  

如圖4所示，經(jīng)Annexin V-FITC染色后利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，經(jīng)假病毒處理的病毒對(duì)照組293FT細(xì)胞凋亡率明顯低于溶媒對(duì)照組，提示HPV假病毒能抑制細(xì)胞凋亡。經(jīng)鬼臼毒素和低、中、高劑量椿乳凝膠處理后的293FT細(xì)胞凋亡率明顯高于病毒對(duì)照，并且椿乳凝膠具有劑量相關(guān)性。

圖4  椿乳凝膠對(duì)293FT細(xì)胞凋亡的影響（n=3）

3.2  椿乳凝膠體內(nèi)試驗(yàn)

3.2.1  一般觀察結(jié)果（定植檢查）

造模后48 h通過(guò)動(dòng)物活體成像系統(tǒng)對(duì)HPV定植進(jìn)行檢查，如圖5所示，模型組熒光強(qiáng)度高，且造模后D22模型組熒光強(qiáng)度仍然較高，提示HPV在陰道體內(nèi)定植良好，維持時(shí)間較長(zhǎng)。一般臨床觀察顯示給藥后各組動(dòng)物一般情況（自主活動(dòng)、攝食攝水等）均未見(jiàn)異常，且陰道外觀無(wú)明顯分泌物和紅腫。

造模后48h

造模后D22

3.2.2  對(duì)陰道pH的影響  

如表3所示，與對(duì)照組比較，給藥第10、20天模型組陰道pH值明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，給藥第10天鬼臼毒素組和椿乳凝膠低、高劑量組陰道pH值均明顯降低（P＜0.05、0.01），給藥第20天各給藥組陰道pH值均明顯降低（P＜0.01）。

表3  椿乳凝膠對(duì)陰道pH值的影響 (, n = 8)

3.2.3  對(duì)宮頸組織病毒滴度的影響 

如表4所示，與對(duì)照組比較，模型組宮頸組織病毒滴度明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組宮頸組織病毒滴度均明顯降低（P＜0.01）

表4  椿乳凝膠對(duì)宮頸組織病毒滴度的影響 (, n = 8)

3.2.4  組織病理學(xué)鏡下觀察  

如圖6所示，對(duì)照組僅個(gè)別動(dòng)物陰道及宮頸組織鏡下可見(jiàn)黏膜上皮細(xì)胞壞死，并伴有少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組宮頸及陰道上皮細(xì)胞壞死，部分動(dòng)物出現(xiàn)上皮細(xì)胞增生，上皮層及黏膜固有層炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；各給藥組陰道及宮頸組織鏡下均可見(jiàn)黏膜上皮細(xì)胞變性壞死，伴有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。小鼠造模后經(jīng)陰道給予不同劑量的椿乳凝膠，陰道組織病變程度變化不明顯，宮頸組織病變有不同程度的減輕。連續(xù)給藥20 d后，各組動(dòng)物子宮組織鏡下觀察未見(jiàn)上皮細(xì)胞增生、壞死及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。

圖6  各組小鼠陰道、宮頸組織病理切片 (HE, ×100)

3.2.5  組織病理學(xué)評(píng)分  

如表5所示，與對(duì)照組比較，模型組宮頸組織病變?cè)u(píng)分明顯升高（P＜0.01），陰道組織病變?cè)u(píng)分有增加趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；與模型組比較，鬼臼毒素組和椿乳凝膠中、高劑量組宮頸組織病變?cè)u(píng)分均明顯降低（P＜0.05、0.01）。各給藥組陰道組織病變?cè)u(píng)分與模型組比較，均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表5  椿乳凝膠對(duì)組織病變?cè)u(píng)分的影響 (, n = 8)

3.2.6  對(duì)HPV6、HPV11的E7蛋白表達(dá)的影響

  如圖7所示，與對(duì)照組比較，模型組HPV6、HPV11的E7蛋白表達(dá)水平均明顯增加（P＜0.01）；與模型組比較，鬼臼毒素組HPV6、HPV11的E7蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01），椿乳凝膠各劑量組HPV11的E7蛋白表達(dá)水平均明顯降低（P＜0.05、0.01），椿乳凝膠中、高劑量組HPV6的E7蛋白表達(dá)水平均明顯降低（P＜0.05、0.01）。

圖7  椿乳凝膠對(duì)小鼠宮頸組織HPV6、HPV11 E7蛋白表達(dá)的影響（n=6）

3.2.7  對(duì)HPV6、HPV11 E6/E7 mRNA表達(dá)的影響  

如圖8所示，對(duì)照組組織中未檢測(cè)到HPV6/HPV11 E6/E7 mRNA表達(dá)；模型組宮頸組織HPV6/HPV11 E6/E7 mRNA表達(dá)水平均明顯增加（P＜0.01）；與模型組比較，鬼臼毒素組HPV6 E6/E7、HPV11 E7 mRNA均明顯降低（P＜0.05、0.01），椿乳凝膠低劑量組HPV6 E7、HPV11 E7 mRNA均明顯降低（P＜0.05），椿乳凝膠中、高劑量組HPV6 E6/E7、HPV11 E7 mRNA均明顯降低（P＜0.05、0.01）。

圖8  椿乳凝膠對(duì)小鼠宮頸組織HPV6、HPV11 E6/E7 mRNA表達(dá)的影響（n=6）

4、討論

尖銳濕疣（condyloma acuminatum，CA）也叫生殖器疣、性病疣，是一種由HPV病毒感染引起的性傳播疾病，主要引起生殖器、肛門(mén)部位增生性損害。據(jù)報(bào)道，全球每10萬(wàn)人中就有近200人感染CA。美國(guó)每年用于CA的直接醫(yī)療費(fèi)用約1.77億美元，而在發(fā)展中國(guó)家，CA造成的影響更加嚴(yán)重。CA傳染性強(qiáng)，并且有一定潛伏期，導(dǎo)致發(fā)病率逐年升高。目前CA治療手段多局限于去除疣體及HPV感染組織，非針對(duì)HPV的病原學(xué)治療，因此該病容易復(fù)發(fā)。研究表明，90%以上的CA都與HPV6和HPV11 2種基因型有關(guān)。

HPV是乳多空病毒科乳頭瘤空泡病毒A屬的病毒，只特異性感染人的上皮細(xì)胞，依靠上皮細(xì)胞的分化途徑來(lái)完成其生命周期。HPV可能通過(guò)上皮表面的微磨損感染上皮基底層的細(xì)胞，利用伴隨傷口愈合的基底細(xì)胞的橫向延伸進(jìn)入細(xì)胞。HPV感染上皮細(xì)胞后，癌蛋白E6、E7可以通過(guò)各種機(jī)制逃避宿主的免疫系統(tǒng)監(jiān)測(cè)，并且將自身基因整合進(jìn)人基因組，使得病毒免于被免疫系統(tǒng)清除。E6和E7還能共同促進(jìn)細(xì)胞增殖、延長(zhǎng)細(xì)胞周期進(jìn)程并防止細(xì)胞凋亡，使得病毒大量復(fù)制。衣殼蛋白L1和L2在上皮的最表層表達(dá)，并且進(jìn)行病毒組裝，最后，新的感染性病毒顆粒從上皮表面脫落。

盡管目前對(duì)于HPV已經(jīng)有廣泛研究，然而對(duì)于低危型HPV的可用數(shù)據(jù)仍然有限。有研究顯示在中國(guó)西南地區(qū)，HPV6是第二流行的HPV類(lèi)型，同時(shí)也是最流行的低危型HPV。因此本研究以最常見(jiàn)的5種低危型HPV類(lèi)型HPV6、HPV11為研究對(duì)象，評(píng)價(jià)椿乳凝膠在體內(nèi)外對(duì)于低危型HPV的抑制作用。

由于HPV真病毒的復(fù)制具有嚴(yán)格的宿主特異性和細(xì)胞分化依賴(lài)性，因此目前并沒(méi)有成功建立HPV體外培養(yǎng)體系，也缺乏合適的動(dòng)物感染模型，構(gòu)建假病毒成為目前HPV研究快速有效的方法。研究發(fā)現(xiàn)，將HPV結(jié)構(gòu)蛋白L1、L2基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化后，可以極大提高其在細(xì)胞中蛋白的表達(dá)，而這2種蛋白能夠自我組裝成病毒樣顆粒（virus-like particles，VLP），其可以將外源性報(bào)告質(zhì)粒包裹進(jìn)病毒顆粒內(nèi)，形成與天然病毒結(jié)構(gòu)相似的假病毒，具有單次感染細(xì)胞的能力，通過(guò)檢測(cè)報(bào)告質(zhì)粒的表達(dá)可以間接反映病毒的感染情況。

椿乳凝膠為株洲千金藥業(yè)股份有限公司自主開(kāi)發(fā)并獨(dú)家生產(chǎn)的純中藥制劑，由椿皮、苦參、牡丹皮、乳香、冰片5味中藥組方而成，具有清熱燥濕、祛瘀生肌的功效，主要用于慢性宮頸炎之宮頸糜爛及中醫(yī)辨證屬于濕熱瘀阻者。根據(jù)其功能主治的特點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)對(duì)椿乳凝膠體內(nèi)及體外抗低危型HPV病毒的藥效學(xué)作用展開(kāi)了研究。本研究成功建立了HPV6、HPV11假病毒感染293FT細(xì)胞的體外模型，發(fā)現(xiàn)假病毒能使細(xì)胞產(chǎn)生病變，影響細(xì)胞周期變化，并且抑制細(xì)胞凋亡。椿乳凝膠干預(yù)可以顯著降低假病毒細(xì)胞感染能力，恢復(fù)細(xì)胞正常周期，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。同時(shí)本研究利用HPV6、HPV11假病毒建立了雌性小鼠生殖器感染體內(nèi)模型，病毒感染上皮細(xì)胞后其包裹的報(bào)告基因可以立即表達(dá)，通過(guò)小動(dòng)物體內(nèi)可見(jiàn)光成像系統(tǒng)檢測(cè)EG  FP熒光表達(dá)可以反映假病毒在上皮細(xì)胞中的感染情況。研究結(jié)果顯示，HPV6、HPV11假病毒成功感染小鼠，宮頸組織中病毒滴度顯著升高，并且HPV6、HPV11的E7蛋白和E6、E7基因表達(dá)水平明顯升高。同時(shí)宮頸組織上皮細(xì)胞出現(xiàn)增生和壞死，伴有明顯炎性浸潤(rùn)，陰道pH值明顯升高，研究顯示正常陰道的酸性環(huán)境可以維持陰道微環(huán)境穩(wěn)態(tài)，抵御HPV感染。椿乳凝膠給藥后，可以有效降低假病毒感染小鼠宮頸組織中的病毒滴度，抑制HPV6、HPV11的E7蛋白和其E6、E7基因的表達(dá)，保護(hù)宮頸上皮細(xì)胞。

綜上所述，通過(guò)體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)證明椿乳凝膠可以明顯抑制低危型HPV復(fù)制，減輕低危型HPV感染引起的組織病變。